Получение образцов ДНК

Получение образцов ДНК

Образцы каких костей следует отбирать? Зубы и кости состоят из тканей, наиболее устойчивых к воздействию окружающей среды, и могут сохраняться вплоть до тысячелетий, когда мягкие ткани истлевают. Поскольку кости и зубы — это биологическая ткань, в них содержатся клетки, из которых можно извлечь ДНК.

Стратегия отбора проб зависит от давности захоронения скелетированных останков и степени их деградации под действием факторов среды. Исследования в контексте судебной экспертизы и криминалистики показали, что в трубчатых костях, в том числе бедренной и большеберцовой, сохраняется больше ДНК, чем в элементах скелета, характеризующихся более высокой долей трубчатой костной ткани — в том числе костях черепа, ребрах и позвонках.

При изучении гораздо более старых или сильно деградировавших образцов внимание стоит уделять прежде всего тканям, более устойчивым к диагенезу — в том числе зубному цементу, дентину и каменистой части височной кости черепа. Исследования показали, что качество и количество ДНК, извлекаемой из этих тканей скелета, на несколько порядков выше, чем при ее извлечении из других костей.

Анатомия зуба и расположение цемента и дентина. Авторское право — Wikimedia Commons, K. D. Schroeder

Расположение и внутренняя анатомия каменистой части. Авторское право — Википедия, Pinhasi et al. 2015. Изменено Eva Fernández-Domínguez

Еще позднее ученые начали использовать слуховые косточки (три мелкие кости во внутреннем ухе) как наилучшие образцы для извлечения ДНК. Дополнительное преимущество слуховых косточек состоит в том, что обычно они защищены от загрязнения и не требуют сверления кости. Для извлечения ДНК необходимы очень небольшие количества порошка костной ткани или тканей зуба (10—50 мг), однако часто для получения этого количества приходится нарушать целостность костных останков, разрезая или сверля кость/зубы, чтобы получить срезы, которые можно передать в лабораторию на анализ. Во избежание излишнего повреждения скелетированных останков всегда следует использовать минимально разрушающие методики пробоотбора.

Возможные проблемы

Анализ ДНК рассматривается как «золотой стандарт» судебной идентификации человеческих останков, однако важно отметить, что в любом судебно-экспертном случае для рассмотрения результатов анализа ДНК столь же важны и необходимы другие вещественные доказательства, связанные с контекстом. Идентификация по ДНК не лишена проблем. Некоторые из этих проблем проистекают из природы и структуры самой ДНК, однако другие связаны с тем, как собирают, хранят и исследуют образцы ДНК.

Порядок хранения, учета и передачи вещественных доказательств

Порядок хранения, учета и передачи вещественных доказательств предполагает регистрацию процесса обнаружения, извлечения, перемещения и анализа образца от места сбора до момента представления результатов в суде. Порядок хранения, учета и передачи вещественных доказательств должен гарантировать, что генетические вещественные доказательства не подменены и никоим образом не пострадали, а все вышеуказанные процессы проведены согласно действующему законодательству и рекомендациям профильных организаций, в том числе Международного общества судебной генетики (ISFG). Если образец отобран ненадлежащим образом (например, при отборе не использовались перчатки), то он может быть загрязнен ДНК человека, проводившего отбор. Если до анализа в лаборатории образец хранился в ненадлежащих условиях (то есть без холодильной или морозильной камеры), то может произойти деградация ДНК. Если вещественные доказательства не были надлежащим образом помечены, то образцы можно спутать. А если для анализа ДНК используются ненадлежащие методики, это может повлиять на достоверность полученных результатов.

Вблизи Аргентинского военного кладбища, пос. Дарвин. Судмедэксперт Мерседес Саладо Пуэрто только что запечатала образцы ДНК в пластиковый пакет со своей подписью и подписью руководителя проекта Морриса Тидболла-Бинца. Их подписи на запечатанном пакете удостоверяют сохранность проб, до тех пор пока образцы не поступят в лаборатории судебной генетики в Аргентине, Испании и Соединенном Королевстве (фотограф Didier Revol, авторское право — МККК)

Деградация ДНК

ДНК может деградировать просто под воздействием факторов среды, в которой хранится биологический образец. Это может произойти и до, и после сбора вещественных доказательств. В целом на сохранность ДНК отрицательно влияют высокие температуры, высокая влажность, высокий или низкий рН. ДНК может деградировать различными способами, однако одним из главных проявлений деградации ДНК является разрыв цепочек ДНК на мелкие фрагменты размером 100—200 пар нуклеотидов (п. н.). Кроме того, в процессе деградации в окружающей среде могут произойти изменения нуклеотидов ДНК, что помешает проведению реакций, необходимых для получения информации в лаборатории («повреждения, блокирующие репликацию»).

Еще более сложными для интерпретации являются модификации, «похожие» на замены отдельных нуклеотидов, так как их можно спутать с истинными мутациями («постмортальные мутации»). Наконец, некоторые соединения («ингибиторы»), содержащиеся в окружающей среде, в которой биологический образец сохранялся до момента отбора ДНК, могут препятствовать извлечению ДНК и генотипированию. Содержащиеся в почве фульвовые и гуминовые кислоты относятся к мощным ингибиторам; к ним же относятся некоторые тканевые белки, в частности меланин (присутствующий в волосах) и гемоглобин (присутствующий в крови). Для успешного генотипирования эти соединения необходимо удалить в процессе экстракции ДНК.

Загрязнение ДНК

Образец человеческой ДНК уязвим для загрязнения человеческой ДНК из других источников. Это загрязнение может произойти в том числе в лаборатории:

• людьми, проводящими анализ;
• за счет перекрестного загрязнения с другими образцами;
• загрязнителями, содержащимися в пластиках и реагентах.

Для предотвращения и минимизации загрязнений такого типа можно принимать различные меры:

• проводить все экспериментальные процедуры в специализированной
• лаборатории судебно-экспертного анализа ДНК;
• регулярно очищать рабочие поверхности отбеливателем или слабой кислотой, использовать средства защиты (перчатки, защитные маски, шапочки и даже комбинезоны для особо важных образцов);
• приобретать пластиковую посуду и реагенты, не содержащие ДНК.

Доступ к судебно-экспертным генетическим лабораториям обычно имеет ограниченный круг лиц, генетические профили которых известны и хранятся в специальной базе данных.

Вблизи Аргентинского военного кладбища, пос. Дарвин. Судебно-экспертная работа продолжается у стола для вскрытия, на котором проводится подробное исследование останков. Помимо документальной фиксации результатов, которые помогут при идентификации (например, пола, возраста, роста, особенностей строения зубов) судебно-медицинские эксперты отберут небольшие образцы костного материала (зубов и костей) для последующего анализа ДНК в генетических лабораториях (фотограф Didier Revol, авторское право — МККК)

Загрязнение, которому образец подвергается до поступления в лабораторию на анализ, можно в какой-то степени снизить, следуя правилам хранения, учета и передачи вещественных доказательств. При исследовании места преступления крайне важно учитывать всех, у кого был доступ к месту преступления и/или кто собирал и отправлял на анализ образцы.

На следующем этапе мы рассмотрим, как образцы древней ДНК готовят к анализу.